PCR

Fördelar

·         PCR är en metod som tar betydligt kortare tid att genomföra jämförelse med en southern.

·         Metoden gör det även möjligt att amplifiera fram ett stort antal kopior av det man vill detektera från en ganska blygsam startkoncentration.

Nackdelar

·         Det är väldigt lätt att proverna cary-over-kontamineras och ger otillförlitliga svar.

Southern

Fördelar

·          Detekterar mindre koncentrationer än vad som kan vara synligt vid en gelelektrofores.

·         Mindre känslig för kontamination av mycket små mängder av sökt gen som inte kommer från ditt ursprungliga prov och skulle kunna ge ett falskt resultat av LL-37:s närvaro.

Nackdelar

·         Tar lång tid och kräver mer materiel

·         Det finns fler steg som kan bli fel och på så sätt bidra till att detekteringen i slutänden inte blir tillförlitlig, tillräcklig eller felaktig.

Det viktigaste jag har lärt mig är framförhållning i laboratoriearbetet.

Jag är nöjd med mitt PCR-resultat även om storleksmarkörerna blivit något otydliga. Brunnarna är laddade på följande sätt sett från vänster till höger.

Neg. Kontroll, Pos. Kontroll, Strlmarkör IX, PCR-amplifikat, Strlmarkör III, Plasmidprep.

Den positiva kontrollen bär två band ett mer distinkt än det andra vilket är den kända LL37-genen som aplifierats genom PCR-reaktionen. Det något mer suddiga bandet bör vara den ursprungliga plasmiden som innehåller insertet LL-37 som utgjort templat i reaktionen.

PCR-amplifikatet från vårt eget prov bildar ett distinkt band i samma höjd på gelen som vår positiva kontroll vilket tyder på att det funnits LL-37 i vår renade plasmidlösning från början. Något längre upp i den fåran återfinns ett litet suddigt band som även det antas vara den större plasmiden som innehåller templatet LL-37 som amplifierats likt den positiva kontrollen. Banden som uppträder på den positiva kontrollen och PCR-amplifikatet liknar varandra så pass mycket i intensitet och position att jag drar slutsatsen att de representerar LL-37 samt oamplifierad plasmid.

För att säkerställa att amplifikatet i mitt PCR-band inte kommer från en carry-over-kontamination tittar jag på min negativa kontroll och ser att det inte finns ett tydligt band som tyder på att någon amplifiering har skett. Det finns en suddig släpande skugga i kontrollen som vandrat längre än prov från de andra brunnarna och det antas vara de primrar som inte hittat något templat att binda till och därmed basparat med andra primrar och bildat primerdimers. Storleksmarkörerna är de band som blivit mest svårtydda men eftersom den positiva kontrollen överensstämmer i vandringssträcka med vårt PCR-amplifikat så bedömmer jag det tillräckligt tillförlitligt för att säga att vi har lyckats rena fram den rekombinanta plasmiden på ett önskvärt sätt.

Plasmidpreparatet är en analys för sig och görs för att undersöka om det förkommer några föroreningar av andra nukleinsyror från värdcellen som plasmiden renats fram från. Kromosomalt DNA som skulle kunna komma från bakteriens stora kromosom som lyserar tillsammans med cellmembranet vid reningsprocessen. DNA-fragment som skulle kunna komama från bakterien skulle synas ganska högt upp  på gelen eftersom den har problem att vandra någon längre sträcka. Vårt prov har inget band uppåt i gelen och jag tolkar det som att det inte finns någon DNA-förorening.

De eventuella RNA-rester som skulle kunna finnas kvar i kolonen efter tvättningarna föregående dag verkar inte heller finnas eftersom vi saknar en svag smear i den undre delen av gelen. Då RNA-fragmenten blir väldigt små skulle de vandra en bra bit mycket längre än de övriga nukleinsyrafragmenten.

Vi har ett starkt band som syns tydligt och det representerar plasmiden som förekommer i supercoilstruktur. Det något svagare bandet ovanför bör symbolisera de plasmider som inte förekommer i supercoilstruktur pga av någon enkelsträngad skada i plasmiden som gjort att den rätat ut sig. Därmed tar den mer plats än de som fortfarande finns i supercoilform och kommer inte vandra lika långt under samma tid. Det är därför inte alltid laddningstätheten som separerar olika bitar i gelen utan även formen på nukleinsyrorna. 

Dagens laborationsuppgift var att rena fram en rekombinant plasmid som replikerats innuti E-koli-bakterier som odlats i buljong. Det första steget är att lysera cellerna så att plasmiderna blir fria i lösningen. Under lyseringen kommer cellvägg såväl som bakteriens eget kromosomala DNA att delas i större bitar och partier som genom centrifugering kommer samlas i en pellet. Även proteiner som förekommer i cellen kommer ansamlas i denna pellet. Cellens RNA som är betydligt mer känslig för nedbrytning kommer att brytas ned i mindre delar och ingå i den supernatant som erhålls innehållande vår plasmid. Supernatanten sparas och pelleten slängs. Vid detta steg skall plasmiden förhoppningsvis vara renad från krom. DNA, cellrester och proteiner, så kallad celldebris.

Tvätt med spincolon

För att rena supernatanten från mindre RNA-fragment tvättas lösningen med hjälp av buffertar och en spincolon. Colonen innehåller en laddningsfördelaktig miljö som får neg laddade nukleinsyror att fastna på dess insida. Då plasmiden är större och innehåller fler neg. Laddningar än de fragment av RNA som finns i lösningen bör konkurrensen om plats gynna plasmiden så att RNA-resterna sköljs bort. Viss kontaminering förekommer dock säkerligen.

Absorbanskurva

Än så länge är det svårt att säga något om resultatet men den koncentrationskontroll vi genomförde med hjälp av spektrofotometern tydde på att provet i fråga anses vara tillräckligt renat. Absorbansen vid två olika våglängder jämfördes, den första där absorbansmaximum för nukleinsyror finns vid 260nm och den andra där absorbansmaximum för proteiner finns vid 280nm. Kvoten de emellan bör infinna sig runt 1,8. En lägre kvot än det tyder på viss proteinförorening då det finns mer protein i lösningen som bidrar till en högre absorbans vilket ger en lägre kvot. Omvänt förhåller det sig med en kvot högre än 1,8 vilket tyder på en viss kontamination av någon nukleinsyra förmodligen RNA. Min kvot uppgick till 1,89 vilket kan tyda på en liten nukleinsyrekontamination men det går inte att säga något om vilken typ av nukleinsyra. Omplasmiden är riktigt ren går inte att bestämma enbart med dessa analyser.