Dagens laborationsuppgift var att rena fram en rekombinant plasmid som replikerats innuti E-koli-bakterier som odlats i buljong. Det första steget är att lysera cellerna så att plasmiderna blir fria i lösningen. Under lyseringen kommer cellvägg såväl som bakteriens eget kromosomala DNA att delas i större bitar och partier som genom centrifugering kommer samlas i en pellet. Även proteiner som förekommer i cellen kommer ansamlas i denna pellet. Cellens RNA som är betydligt mer känslig för nedbrytning kommer att brytas ned i mindre delar och ingå i den supernatant som erhålls innehållande vår plasmid. Supernatanten sparas och pelleten slängs. Vid detta steg skall plasmiden förhoppningsvis vara renad från krom. DNA, cellrester och proteiner, så kallad celldebris.

Tvätt med spincolon

För att rena supernatanten från mindre RNA-fragment tvättas lösningen med hjälp av buffertar och en spincolon. Colonen innehåller en laddningsfördelaktig miljö som får neg laddade nukleinsyror att fastna på dess insida. Då plasmiden är större och innehåller fler neg. Laddningar än de fragment av RNA som finns i lösningen bör konkurrensen om plats gynna plasmiden så att RNA-resterna sköljs bort. Viss kontaminering förekommer dock säkerligen.

Absorbanskurva

Än så länge är det svårt att säga något om resultatet men den koncentrationskontroll vi genomförde med hjälp av spektrofotometern tydde på att provet i fråga anses vara tillräckligt renat. Absorbansen vid två olika våglängder jämfördes, den första där absorbansmaximum för nukleinsyror finns vid 260nm och den andra där absorbansmaximum för proteiner finns vid 280nm. Kvoten de emellan bör infinna sig runt 1,8. En lägre kvot än det tyder på viss proteinförorening då det finns mer protein i lösningen som bidrar till en högre absorbans vilket ger en lägre kvot. Omvänt förhåller det sig med en kvot högre än 1,8 vilket tyder på en viss kontamination av någon nukleinsyra förmodligen RNA. Min kvot uppgick till 1,89 vilket kan tyda på en liten nukleinsyrekontamination men det går inte att säga något om vilken typ av nukleinsyra. Omplasmiden är riktigt ren går inte att bestämma enbart med dessa analyser.